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    重慶光電暗場生物顯微鏡觀察細菌的方法

         生活的細菌在暗場顯微鏡下觀察是透明的,不易看清。暗視野生物顯微鏡的原理與來自縫隙的一束強光通過暗室時,可清楚地看到其中細微灰塵的現象是一樣的,即給樣品照明的光不直接穿過物鏡,而是由樣品上反射或折射的光進入物鏡,那么,在漆黑的視野中,由于反差增大了,使樣品能夠看得更清楚。因用暗視野法可以在黑暗的視野中看到光亮的菌體,故在觀察生活細菌及細菌運動時常采用此法。

      暗視野生物顯微鏡的構造主要是采用一種特殊的聚光器,在聚光器的下方中央為圓形黑盤所遮,光僅由周緣進入,使光會聚于載玻片上,并斜照物體,物體經斜射照明后,發出反射光可進入物鏡,這樣,造成生物顯微鏡視野黑暗,而其中的物體明亮。如無暗視野生物顯微鏡時,只需將明視野顯微鏡上的聚光器取下,換上暗視野聚光器即可;也可在明視野顯微鏡聚光器下面的濾光鏡支架上放一片星形擋板(star diaphragm)(圖-6)構成暗視野,這種方法適用于低倍鏡觀察。

      在暗視野中,由于有些活細胞其外表比死細胞明亮,所以暗視野也被用來區分死、活細胞,此技術現已被用于各種酵母細胞的死、活鑒別。此外,暗視野顯微鏡對于觀察嬌弱的微生物,如梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)特別有用。

      、器材

      釀酒酵母(Saccharomy-ces cerevisiae);

      暗視野顯微鏡,載玻片,蓋玻片,無菌水。

     、操作步驟

      1.選厚薄在10—12mm的干凈載玻片一塊,滴上釀酒酵母懸液,加蓋玻片(注意切勿有氣泡存在)。

      2.將聚光鏡光圈調至14。

      3.光源的光圈孔調至最大。

      4.在聚光器上放一大滴香柏油,將標本置載物臺上,旋上聚光器使油與載玻片接觸(不能有氣泡發生)。

      5.用低倍物鏡及目鏡進行配光對準物體。調節聚光器的高度,首先在載玻片上出現一個中間有一黑點的光圈,最后為一光亮的光點(圖-7),光點愈小愈好,由此點將聚光器上下移動時均使光點增大。

      6.換上所需目鏡和高倍鏡,緩慢上升物鏡進行調焦,至視野中心出現發光的樣品。

      7.在蓋玻片上滴一滴香柏油,并將油鏡轉至應在位置調節配光,進行觀察。

      、注意事項

      1.進行暗視野觀察時,聚光鏡與載玻片之間滴加的香柏油要充滿,否則照明光線于聚光鏡上面進行全面反射,達不到被檢物體,從而不能得到暗視野照明。

      2.在進行暗視野觀察標本前,一定要進行聚光鏡的中心調節和調焦,使焦點與被檢物體一致。

      3.由于暗視野聚光鏡的數值孔徑都較大( NA=12—14),焦點較淺,因此,過厚被檢物體無法調在聚光鏡焦點處,一般載玻片厚度為10mm左右,蓋玻片厚度宜在016mm以下,同時載玻片、蓋玻片應很清潔,無油脂及劃痕,否則都會嚴重地擾亂最終的像


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